二代宏转录组测序

A、定义

二代宏转录组测序（Metatranscriptomic Sequencing）是一种对样本中全部RNA分子进行无偏倚高通量测序的技术，可用于分析：

·       微生物群落的活跃表达谱

·       RNA 病毒检测

·       病原体转录活性

·       宿主-微生物互作

宏病毒组测序（Viral Metagenomics）是宏转录组的一种重要应用，专注于：

·       RNA 病毒检测

·       DNA 病毒转录活性

·       新发/未知病毒筛查

与 DNA 宏基因组相比，宏转录组测序能够反映：

微生物“谁在表达、表达什么、表达多少”

广泛应用于感染性疾病研究、呼吸道/肠道病毒监测、环境病毒学和宿主-病原互作研究。

B、实验方案

1️ 技术原理

1.       提取样本总 RNA

2.       去除 rRNA（宿主 + 微生物）

3.       反转录为 cDNA

4.       文库构建

5.       高通量测序

6.       生物信息分析（物种 + 功能）

2️ 实验类型

·       全宏转录组测序（Total RNA-seq）

·       病毒富集宏转录组

·       RNA 病毒特异性建库

·       宏转录组 + 宿主表达联合分析

3️ 样本类型

·       呼吸道样本（鼻咽拭子、痰液）

·       粪便

·       血液/血浆

·       脑脊液

·       组织样本

·       环境样本（水体、污水）

C、测序策略

1️ 建库模式

·       双端测序（PE150 推荐）

·       rRNA depletion 文库优于 polyA 富集（适合病毒检测）

2️ 推荐测序深度

研究目的	推荐数据量
常规宏转录组	≥10–15 Gb/样本
低丰度病毒检测	≥20–30 Gb/样本
临床 mNGS 病原筛查	≥20 Gb/样本
环境病毒监测	≥30 Gb/样本

 

3️ 数据分析流程

·       原始数据质控（Fastp）

·       去 rRNA 序列

·       去宿主序列（Bowtie2）

·       病毒/微生物注释（Kraken2 / Kaiju / Diamond）

·       丰度分析

·       差异表达分析

·       病毒组装（MEGAHIT / SPAdes）

·       新病毒预测

4️ 关键质控指标

·       Q30 ≥ 85%

·       rRNA 去除效率

·       宿主污染比例

·       有效 reads 比例

D、应用方案

🦠 感染性疾病检测（mNGS）

·       未知病原体筛查

·       RNA 病毒检测（如 SARS-CoV-2、流感病毒）

·       混合感染鉴定

🔬 宿主-病原互作研究

·       病毒感染过程中宿主转录变化

·       炎症通路激活

·       免疫应答动态

🌍 环境病毒监测

·       污水流行病学

·       新发病毒监测

·       病毒生态多样性分析

🧬 微生物功能研究

·       活跃代谢通路

·       抗性基因表达

·       群落功能动态

E、送样建议

1️ RNA 质量要求

·       RIN ≥ 7（优选）

·       OD260/280 = 1.8–2.1

·       无明显降解

2️ 样本保存

·       -80℃ 保存

·       使用 RNA 稳定液

·       避免反复冻融

3️ 病毒检测样本

·       无菌采集

·       尽量减少宿主 RNA 污染

·       及时冷冻

4️ 血液/体液样本

·       建议血浆优于全血

·       及时分离保存

F、常见 FAQ（科研导向版）

Q1：宏转录组与宏基因组的区别？

项目	宏基因组	宏转录组
检测对象	DNA	RNA
是否反映活性	否	是
RNA 病毒检测	不适合	适合
功能分析	基因潜力	实际表达

 

Q2：是否可以检测 RNA 病毒？

可以，这是宏转录组的重要优势。

Q3：宿主 RNA 污染高怎么办？

·       优化样本采集

·       使用 rRNA depletion

·       去宿主比对过滤

·       增加测序深度

Q4：是否必须做生物学重复？

科研研究建议：

·       每组 ≥3 个生物学重复

·       同批次建库

Q5：宏转录组是否可用于临床诊断？

可以（RNA mNGS），但需：

·       严格污染控制

·       临床解读规范

·       高测序深度

G、经典文献

1.       Greninger, A. L. et al. (2015). Rapid metagenomic identification of viral pathogens. Genome Medicine.

2.       Wilson, M. R. et al. (2019). Clinical metagenomic sequencing for pathogen detection. NEJM.

3.       Shi, M. et al. (2016). Redefining the invertebrate RNA virosphere. Nature.

4.       Zhang, Y. Z. et al. (2018). Expanding the RNA virosphere by unbiased sequencing. Nature.

5.       Franzosa, E. A. et al. (2018). Species-level functional profiling of metatranscriptomes. Nature Methods.